Hauptsitze des Fraunhofer IOSB sind Karlsruhe und Ettlingen; hinzu kommen als weitere große Standorte der Institutsteil für angewandte Systemtechnik AST in Ilmenau und der Institutsteil für industrielle Automation INA in Lemgo.
Daneben betreibt das Fraunhofer IOSB eine Reihe Zweigstellen zur themenzentrierten Kooperation mit Partnern vor Ort. Etabliert sind das Kontaktbüro in Beijing zur Betreuung des chinesischen Marktes, die Forschungsgruppe IT-Sicherheit für Kritische Infrastrukturen Energie und Wasser in Görlitz (Kooperation mit der Hochschule Görlitz) und die Forschungsgruppe Smart Ocean Technologies SOT in Rostock (gemeinsam mit den Fraunhofer-Instituten IGD, IGP und IKTS im Rahmen des Ocean Technology Campus Rostock) .
2021/2022 sind mit der neu eröffneten Karlsruher Forschungsfabrik für KI-integrierte Produktion (gemeinsam mit KIT und Fraunhofer ICT), dem Fraunhofer-Zentrum für die Sicherheit Sozio-Technischer Systeme SIRIOS in Berlin (gemeinsam mit den Fraunhofer-Instituten FOKUS, EMI und IVI) sowie der neu aufzubauenden Forschungsgruppe Aktive Laserfasern in Oberkochen (in enger Anbindung an die Industrie vor Ort) weitere Zweigstellen hinzugekommen.